二代试管绕开自然选择_中心生殖医院供卵试管_[三代试管婴儿成功率]HBV感染者

　　赵皖秋, 任文娟, 李伟, 刘珊·(陕西省妇幼保健院生殖中心.西安 710003试管婴儿费用)【摘要】 目的 检测父/母为乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染者的胚胎中是否存在 HBV DNA,探讨 HBV经配子垂直传播的可能性,同时评估影响垂直传播发生的相关因素 方法 收集单方 HBV感染的229对夫妻的3lo个废弃胚胎。采用套式聚合酶能反应(PCR)法测定胚胎样本中的 HBV DMA。采用 Logistic回归分析患者年龄、血清 HBV DNA载量、血清HBV多种抗原或抗体存在情况及授精方法等因素与 HBV DMA存在的相关性。 结果 7 74%(24/3lo)的胚胎中检出了HBV DNA;血清 HBV DNA载量与胚胎中存在 HBVDMA呈显著正相关;授精方式(IVF或 ICSI)的差异对胚胎 HBV DNA阳性检査率几乎无影响(P>0 o5);同一对夫妻的多个胚胎中只有部分胚胎存在 HBV DNA。 结论 垂直传播可能是 HBV重要的传播途径之一。对子 HBV DNA高载量的父/母,自然受孕或助孕治疗前建议进行针对性治疗,以降低胚胎感染 HBV的风险 。【关键词】 乙型肝炎病毒; 胚胎; 垂直传播; HBV载量乙型肝炎病毒( HBV)感染可导致急慢性肝炎、肝硬化以及肝细胞癌, 全球约20亿人感染HBV,其中超过3. 50亿人为慢性感染,中国做为 HBV感染高发地区,约60%的不孕不育中国人有 HBV 感染史, 9. 8%的中国人为 HBV慢性感染者。 HBV感染高发的一个重要原因是 HBV可以垂直传播,估计超过30%的 HBV感染是通过母婴垂直传播获得。母婴垂直传播可分为产前传播、产时传播及产后传播, 产前传播也称宫内传播,通常认为 HBV突破胎盘屏障是造成胎儿宫内感染的最主要原因;产时传播主要是指胎儿在分娩过程中,由于宫缩而吞咽含有 HBV的母体血液、羊水以及阴道分泌物等母体体液,或因为胎意血管破裂,母血渗入胎儿血液中造成母婴垂直传播;产后传播即通过接触父母唾液、母乳喂养以及其他生活上的密切接触而造成的 HBV感染。传统观念认为,乙肝的垂直传播就是母婴垂直传播,但自 Hadchoue1等研究发现 HBV DNA可整合到精子基因组中后,越来越多的研究提示 HBV可能经过精子垂直传播。近期的研究则发现 HBV DNA可整合入仓鼠卵母细胞基因组中, HBV感染者不同发育阶段的卵母细胞均可检出乙肝核心抗原(HBcAg)和 HBV DNA,提示 HBV感染可能经过生殖细胞(精子和卵母细胞)发生垂直传播。目前,虽然有间接证据提示 HBV可能通过感染生殖细胞进行垂直传播,但尚缺乏足够的直接证据支持, 本研究通过检测父/母为 HBV慢性感染者的废弃胚胎中是否存在 HBV DNA,为 HBV是否可通过生殖细胞传播提供直接证据,同时评估影响该垂直传播发生的相关因素。材料与方法一、主要设备与试剂Applied Biosystems Veriti96 We11 Therma1 Cycler PCR仪购自美国 Life Techno1ogies公司; Bio-RAD PowerPac电泳仪购自美国伯乐公司;JS680CR全自动凝胶成像分析仪购自上海培清科技有限公司;HBV DNA Detection试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。二、研究方法1.样本收集及处理:实验样本来源于2012年9月至2014年3月在我院辅助生殖中心行辅助生殖助孕治疗、单方 HBV感染的229对不育夫妇的废弃胚胎(共310个), 本研究将乙肝表面抗原( HBsAg)阳性持续半年以上者认定为 HBV感染, 从单纯男方 HBV感染的140对夫妇中获得废弃胚胎181个,从单纯女方 HBV感染的89对夫妇中获得废弃胚胎129个,本研究经我院伦理委员会审议通过,并患者知情同意.上述单方 HBV感染者均进行了乙肝七项检测:乙肝表面抗体(HBsAb)、乙肝 e抗原(HBeAg)、乙肝 e抗体(HBeAb)、乙肝核心抗体(HBcAb)、乙肝核心 IgM型抗体(HBcAb-IgM)和乙肝 S1抗原(HBSIAg)及血清 HBV DNA载量测定。另外,选取同期在我院接受辅助生殖助孕治疗、未感染 HBV的不育夫妇的废弃胚胎80例做为阴性对照。本研究所纳入胚胎均为人工授精后培养 72 h的废弃胚胎(异常受精或低于移植标准的胚胎), 经PBS清洗3次后,用毛细吸管将胚胎移入聚合酶链反应(PCR)管底,液氮冻存备用。三、HBV DNA检测使用 HBV DNA Detection试剂盒检测胚胎中是否存在 HBV DNA。采用套式 PCR法特异性扩增乙肝病毒 DNA中的 S基因(基因序列第506~ 645) ,S基因编码合成乙肝表面抗原的主蛋白,其与前 S抗原共同组成乙肝表面抗原。因商品试剂盒PCR引物序列保密,故本文不能提供引物序列信息。首次 PCR扩增的产物大小约510 bp,二次PCR扩增的产物大小约230 bp。以试剂盒提供的阳性模版做为阳性对照,其首次 PCR扩增产物大小约603 bp,次 PCR扩增产物大小约350 bp。套式 PCR操作如下:向含有胚胎样本的 PCR 管中直接加入 PCR反应液25 μ1,振荡、离心后,按以下条件进行第1次扩增:94℃预变性1 min,94℃变性30 s,55℃复性30 s,72℃延伸30 s,共30个循环;再取2 μ1第1次扩增产物做为模版,加入23 μ1 PCR反应液,按以下条件进行第2次扩增: 94℃变性30 s,55℃复性30 s,72℃延伸30 s,共35个循环, 扩增产物进行 2%的琼脂糖凝胶电泳,显示特异性扩增条带者视为 HBV D1、1A阳性。HBV DNA载量的测定,则按照临床常规,由我院临床检验科统一测定。四、统计学分析采用 SPSS13. 0软件进行数据统计分析,分类变量比较来用卡方检验,相关性分析来用 Logistic 回归分析, P106/m1)与胚胎 HBV感染具有显著相关性(P0 05)(表1)。研究结果还发现:4对单纯男性 HBV感染和5 对单纯女性 HBV感染夫妻同一批次多个胚胎中, 仅有1个胚胎检出 HBV DNA,并非所有受检胚胎 HBV DNA均为阳性（表3），提示源于同一对夫妻的多个胚胎中只有部分胚胎感染HBV。

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讨 论Hadchoue1等研究首次发现 HBV DNA可退出全屏整合到精子基因组中,其他研究通过荧光原位杂交方法亦观察到 HBV的基因序列整合到精子染色体上。 Ali等从分化出1~2个细胞的胚胎中发现了 HBV基因,而该胚胎来源于感染了 HBV的人类精子与仓鼠去透明带卵母细胞的体外受精操作。以上研究提示 HBV可能经精子垂直传播给胚胎。对女性 HBV感染者的研究-也发现, HBsAg、HBcAg和 HBV DNA在不同发育阶段的卵细胞和卵巢组织中均可检出,且 HBV DNA可整合入仓鼠卵母细胞基因组中,提示 HBV也可能经卵细胞垂直传播,但是,目前对于 HBV通过生殖细胞垂直传播的直接证据研究尚少, 本研究结果显示,单纯男方 HBV感染的140对夫妻中13例(9 .3%)胚胎检测到阳性结果,单纯女方 HBV感染的89对夫妻中11例(12. 4%)胚胎检测到阳性结果,在体外条件下的废弃胚胎中检测到 HBV DNA，提示人类精子或卵细胞可能作为裁体将 HBV传播给胚胎。上述实验结果为“HBV经生殖细胞垂直传播”的假说提供了直接证据。本研究还发现，源于同一对夫妻的同批次多个胚胎，只有部分胚胎检出HBV DNA，表明HBV对精子和卵母细胞的感染具有一定限制性，其具体机制尚需进一步的三代试管婴儿成功率研究。其中不同卵母细胞感染HBV的差异性，可能与卵母细胞透明带的高度异构性有关。此外,在本研究中,废弃胚胎中的 HBV DNA需重复 PCR后才能检测到,表明HBV DNA 在感染胚胎中含量极低,提示HBV DNA在胚胎中不复制或仅极低水平的复制,其具体发生机制亦需要后续的深入研究来验证。与模拟自然受精的 IVF不同,ICSI是将精子通过显微注射注入卵母细胞,由于直接跨过了透明带的保护,外部 HBV有可能直接进入胚胎,从而增加HBV感染的可能性,因此,欧洲许多国家反对为HBV感染者行 ICSI。 目前,对于使用 HBV感染者精液行 ICSI后是否会增加胚胎 HBV感染率尚存在争议,而对于单纯女性 HBV感染者卵母细胞行 ICSI后是否增加胚胎 HBV感染率则尚无研究报道。 本研究结果显示,单纯男方 HBV感染时,行 ICSI助孕操作后胚胎 HBV DMA的阳性率略高于行 IVF的胚胎,但差异无统计学意义(P> 0 .05) ;单纯女方为 HBV感染时,行 ICSI助孕操作后胚胎 HBV DNA的阳性率低于行 IVF的胚胎,但差异亦无统计学意义(P> 0. 05) 。 ICSI是否会显著增加胚胎感染 HBV的几率,尚需更大样本的研究探讨三代试管婴儿成功率。已有研究报道母亲 HBeAg阳性和高血清HBV DNA水平能增加 HBV垂直传播的风险,其中 HBV宫内传播的风险与 HBV DNA水平密切相关, HBV DNA水平较 HBeAg水平更能体现胎儿免疫预防 HBV感染的失败率,为确定经生殖细胞垂直感染 HBV与 HBeAg阳性、高血清 HBV DNA水平等影响因素的相关性,本研究分析了男/女方年龄、 HBsAb、 HBeAg、 HBeAb、HBcAb、HBclgM-Ab、HBSIAg及血清 HBV DNA 载量等因素与胚胎 HBV感染的相关性。经 Logistic 回归分析发现仅血清 HBV DNA高载量与胚胎HBV感染呈显著性正相关,表明高浓度的 HBV环境可显著增加胚胎 HBV感染率,提示 HBV感染者孕前应检测血清 HBV DNA载量,对于高载量的患者应进行相应治疗,在降低HBV DNA载量后再怀孕，以降低胚胎感染HBV的可能性。综上所临汾装修工长述，无论男方或女方感染HBV，均可能出现胚胎，提示经生殖细胞（精子和卵母细胞）垂直传播可能是HBV重要的传播途径之一。对于男方或女方感染HBV者，临床上进行ICSI或IVF辅助治疗前要进行综合评价，对于HBV DNA高载量的父/母，自然受孕或进行辅助生殖助孕治疗前均应进行针对性治疗，以降低胚胎感染HBV的风险。

「孕产」人的生育年龄也可以计算，你知道吗？

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美华人供卵第一成功促国会就排华法案道歉后转向宣传教育

　　1882年，美国国会通过了《排华法案》号法案，粗暴践踏人权，给在美华人带来了极大的屈辱和灾难。2009年，160多个中国组织联名上书，要求美国国会为《排华法案》道歉，最终被称为“1882计划”。随后，在中国国会议员赵美心和中国组织的推动下，美国参众两院分别于2011年和2012年通过了为《排华法案》向华人和亚洲人道歉的议案。

　　本月恰逢美国亚太遗产月。正在成立的1882基金会(1882计划的继承者)近日在华盛顿举办了华裔美国人历史上的首次研讨会，中国博物馆、中国历史研究会和美国联邦政府相关机构参加，讨论1882计划的下一步工作，加强华裔美国人相关群体之间的协调，加强与联邦相关机构的合作。

　　这是前所未有的成功，也是中国历史上的第一次。来自美国华人四大博物馆——纽约华人博物馆、洛杉矶华人博物馆、蛋饲第一旧金山华人博物馆、西雅图华人博物馆、旧金山附近天使岛移民纪念馆、美国华人历史学会、美国华人协会、美国华人全国委员会、联邦国土安全部下属移民局、第一农业部下属林业局、蛋饲第一国家档案馆、国家公园服务局、史密森学会的代表参加了为期两天的会议。会议结束时，国会议员赵美心出席并发表讲话，对这一前所未有的盛会给予充分赞扬。

　　这次会议主要讨论了1882计划成功推动国会道歉法案后，如何从政治立法阶段转变为教育宣传阶段，如何先给蛋再给蛋，以及华人社区和美国社会接下来的具体步骤。会议一致同意今后每年5月召开，推动成立1882纪念基金会，负责长期协调华人社区内部以及华人社区与联邦机构之间的合作事宜。会议决定更新学校教科书，充实中国博物馆，宣传1882年排华法案的历史影响，及时保护各地美籍华人的历史文物。

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　　主要负责推动这次会议的1882计划联合主席蒋全火说：“这次会议具有历史意义。它凝聚了中国社会的共识，将1882计划推向了中国社会和美国社会。这是我们的1882计划和中国社会必须迈出的一大步。”美国华裔全国委员会主席薛海培说：“作为中国新移民的一员，我认为1882计划向教育和宣传的成功转变，将使新移民和我们的下一代有更多的机会了解我们的过去和美国的历史。第一次捐卵会把过去的历史和我们未来的融合在了一起。结束

　　我国实施高温补贴政策已经很多年了，但是很多地方的标准已经好几年没有涨了，高温补贴的实施遇到了尴尬。东莞农民工：每天坐9小时.66833